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第二节 寄生虫人工培养
本书仅介绍三种原虫的人工培养。
一、溶组织内阿米巴培养。
1.营养琼脂双相培养基
⑴固体部分：牛肉浸膏3g；蛋白胨5g；琼脂 15g；液体1000ml（见“液体部分”）。
⑵液体部分：氯化钠8g；氯化钾0.2g；氯化钙0.2g；氯化镁0.01g；磷酸氢二钠2g；磷酸二氢钾0.3g；蒸馏水1000ml。
制备先配液体部分2000ml，氯化钙与氯化镁另装小瓶，高压灭菌（压力6.81公斤20分钟）后冷却，合并一起，取1000ml配固体部分，经沸水浴2～3小时，使完全溶解。若有残渣可用4层纱布过滤除去，趁热将滤液分装试管，每管5ml，高压灭菌，形成斜面，冷却后放冰箱中备用。接种前，每管加液体部分4.5ml和牛血清0.5ml，并加米粉20mg（用大米粉分装小管，经180℃烤箱消毒3次）。
2.洛克氏液鸡蛋血清培养基
⑴培基成分：洛克氏液70ml；灭活血清（每管加0.5ml）；米粉（每管加20mg）；鸡蛋4个。
⑵洛克氏（Locke）液：氯化钠9g；氯化钙0.2g；氯化钾0.4g；碳酸氢钠0.2g；葡萄糖（压力3.63公斤15分钟）2.5g；蒸馏水1000ml。
制备先配洛克氏液1000ml，取鸡蛋用肥皂水洗刷净，以70%酒精洗净后，破壳将蛋黄、蛋清倾入含70ml洛克氏液的小三角烧瓶内，加有玻璃珠，充分摇动使其内含物混合，之后分装消毒试管内，每管约5ml，置斜位在70℃下经1小时凝固斜面，翌日再置高压消毒20分钟。接种前每管加洛克氏液4.5ml、马血清0.5ml、米粉20mg。
二、阴道毛滴虫培养
常用肝-胨-糖培养基的培养方法。
1.培养基的配制：15%肝浸液100ml；蛋白胨2g；葡萄糖0.5g。
将以上成分混合，加热使溶，经滤纸过滤，调节pH至5.5～6.0。每管分装5ml，8磅20分钟高压灭菌，冷却后，置37℃恒温箱中24小时，证明无菌后，贮存于冰箱备用。接种前每管加灭能无菌马血清1ml，即可用。
15%肝浸液的制备：取牛或兔肝15g，洗净，剪碎如小米粒大小，浸入100ml，蒸馏水中，置冰箱过夜，次日煮沸半小时，用4层纱布过滤除去渣滓，补充蒸馏水至100ml，即成15%肝浸液。
2.培养方法①以无菌棉拭从阴道后穹窿处取分泌物，无菌接种入上述的培养基中；②初次接种和第1、2次转种时，应加青霉素5～10万单位/2ml培基；③培养温度为35～38℃为宜；④pH在5.4～6.8之间。
第三节 寄生虫实验动物保种
寄生虫的动物保种，是将其感染期接种于实验动物，使虫体在动物体内存活，以利于寄生虫与寄生虫病的研究、寄生虫病诊断以及制备教学标本等。
一、杜氏利什曼原虫无鞭毛体
取患者的前述组织穿刺物，用适量生理盐水稀释后，注射于田鼠（或金黄地鼠）腹腔内，每只鼠注射0.5ml，放笼内饲养。一个月后杀死田鼠，取其肝、脾组织作涂片，染色，镜检。转种时将感染利肝曼原虫的田鼠解剖，取其肝、脾置于消毒的组织研磨器中或研钵中，加入少量生理盐水研磨为匀浆后，再加适量生理盐水稀释，用消毒注射器吸取稀释液注射健康田鼠腹腔内，每只鼠注入0.2～0.5ml，继续饲养。3～4周后，按前述方法进行检查。原虫在动物体内可生存数月。
二、刚地弓形虫
经穿刺抽取病人的脑脊液0.5～1ml，注射于体重18～25g的健康小白鼠腹腔内。3周后抽取小白鼠腹腔液作涂片检查（查滋养体）。如为阴性再取肝、脾、脑组织研磨为匀浆，按1:10量加入无菌生理盐水稀释，进行第二次接种。如仍为阴性可用同法进行2～3次，再观察结果。阳性者可作接种传代，每2周一次，以保种。
接种小鼠，每只注射0.3～0.5ml的匀浆。感染后每天观察，即抽取腹腔液涂片，染色后观察。一般感染第四天可见到弓形虫滋养体。
抽取病鼠腹腔液方法，是在其腹部作一切口，用镊子夹提腹部的皮肤和腹膜，用1ml注射器吸取1ml生理盐水，迅速注入腹腔，轻揉腹壁，使生理盐水和腹腔液混匀，然后再抽出腹腔液检查。
三、旋毛虫
将感染旋毛虫的小白鼠（或大白鼠）杀死，剥皮，取其肌肉；也可取含有幼虫的猪肉，剪成米粒大小，取1小块肉置在载玻片上压片检查，以含有100～200个幼虫囊包量的肌肉，经口喂健康小白鼠，喂前应饥饿小鼠24小时；或将含有幼虫囊包的肌肉剪碎，置于含有消化液的三角瓶内，一般每1g肌肉加入60ml的消化液，置37～40℃温箱中，经10～18小时（此间经常摇动烧瓶或搅拌），去掉上层液，然后以水洗沉淀法或离心沉淀法收集幼虫。以生理盐水洗涤2～3次，用1ml的注射器和8号针头吸取100～200条幼虫，经腹腔注射或喂饲健康小白鼠（或大白鼠）。感染第5周后，可在鼠肌中（以膈肌、腿部肌多见）可找到幼虫囊包。幼虫在动物体内可生存3个月或半年。
四、血吸虫
1.实验动物一般用18～22g体重的健康小白鼠或2～4kg家兔。
2.尾蚴逸出将阳性钉螺2～3只放入指管（1×7cm）中、加入去氯水或冷开水至管口，管口盖以铜丝网，以防钉螺爬出。置25℃孵育4～12小时，尾蚴可陆续逸出浮于水面。
3.感染动物将小白鼠或家兔仰卧固定在木板上，剪去腹毛，范围约5×5cm约1～2张盖片大小），用清水洗净腹部皮肤。用白金耳沾取液面的尾蚴置于盖玻片上，在解剖镜下计算尾蚴数量。通常感染小白鼠每只50条尾蚴，家兔500～800条即可。将含已计数尾蚴的盖片，翻转覆盖在动物腹部的去毛处，使其与皮肤接触，同时在盖片与皮肤之间滴加少许清水，以保持湿润；冬季应保持温度在25℃左右，15～20分钟后取下盖片。感染后约40～45天，即能在动物粪便中查到虫卵。操作中应防止感染，用过器材应消毒。
五、华支睾吸虫
常用实验动物有猫、犬、豚鼠、大白鼠、兔等。取含有华支睾吸虫囊蚴的鱼肉，用人工消化液消化后收集纯净的囊蚴。将囊蚴拌入饲料喂食或直接从口内插入橡皮管注入胃内。感染囊蚴的数量，因动物大小而异，以200～400个为宜。感染后一个月，即可自粪便内检获虫卵。
六、卫氏并殖吸虫
常用实验动物有犬、猫。将感染该种吸虫囊蚴的溪蟹或蝲蛄，放入清水中洗净后，用研钵或绞肉机捣碎，经筛过滤去除粗壳渣，以沉淀法反复清洗至水清。吸出沉渣放在双筒解剖镜下检查，用滴管吸取囊蚴并计数，将定量囊蚴拌入饲料喂动物。也可将囊蚴放入含有2%胆酸盐溶液中，置40℃1小时，使后尾蚴脱囊。用无菌生理盐水洗涤后，给猫或犬进行腹腔注射。幼虫数量以100～300个为宜。约2个月后可在粪便中检出虫卵。
注：人工消化液配方
盐酸 0.4ml
胃蛋白酶 25g
蒸馏水100ml
第四节 寄生虫标本的保存
寄生虫标本的保存，除制成玻片标本永久保存外，还可用以下各种保存方法。
一、原虫包囊和虫卵的保存
汞碘醛液10ml与粪便1g混匀后密封在瓶内，可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久，也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10%甲醛液（加热至70℃），摇匀，用石蜡封固瓶口。
二、蠕虫成虫的保存
1.线虫 生理盐水洗净后用加热至70～80℃的70%酒精或巴氏液（甲醛3份，生理盐水97份固定，冷却后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型线虫（如旋毛虫、蛲虫、钩虫等）宜用甘油酒精（70%酒精95ml，甘油5ml）加热固定，保存于80%酒精中；也可用冰醋酸固定约半小时后移入70%酒精或甘油酒精中保存。
2.吸虫 小型吸虫可置于小瓶中，加生理盐水，用力摇荡数分钟，倒去生理盐水，注入固定液。较大的吸虫应先放在薄荷脑酒精液（薄荷脑24g，95%酒精10ml）中，使虫体肌肉松弛，用载玻片压平后固定，或将洗净后的吸虫放在两片载玻片间用细线紧扎压平后固定。
固定一般用10%甲醛，24小时后移至5%甲醛中保存；或用70%酒精固定0.5～3小时，视虫体大小而定，再移至新的70%酒精中保存。
3.绦虫 大型绦虫（如猪、牛带绦虫）经清水洗涤数次后，在生理盐水（4℃）中经过数小时或过夜，虫体可完全伸展，此时以3%福尔马林固定，24小时后移至5%福尔马林中保存，必要时也可先用大玻璃板压平后固定。小型绦虫洗涤后可在3%福尔马林中固定3～5小时，用载玻片轻压，沿盖玻片边缘加5%甲醛固定数小时，最后保存在5%福尔马林溶液中。
三、昆虫的保存
1.干标本保存系保存有翅昆虫成虫。可用特制的昆虫针针插虫体。大型昆虫（蝇、虻等）用1～3号昆虫针，从虫体背面、中胸右侧直插（图21-9）。注意保持左侧完整，以便鉴定。小型昆虫（蚊、蛉、蚋、蠓等）可用00号短针自胸部腹面两中足基部之间插入，不可刺透胸背，再用另一长针从软木片另一端插下。最后各插一硬纸片，记录名称、采集地点与时间，并将之插于昆虫盒软木板上或玻璃管的软木塞上。昆虫盒内放入纸包的樟脑粉即可。如标本数量多（图21-9），可保存于塑料管（或
玻璃管）中，管底放少量樟脑粉，再铺上棉花、滤纸各一层，昆虫标本放于滤纸上，用软棉纸包棉花，轻塞在昆虫标本上方，瓶口加软木塞，再以蜡封之。
图21－9 有翅昆虫针插法
2.湿标本保存用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和蜱螨类的发育各期。活标本先经加温的70%酒精（60～70℃）固定，一天后保存于5%甘油酒精（7%）中；也可用5%或10%福尔马林和Bless液固定保存。
所有保存标本须详细记录标本名称、宿主、采集地点、采集日期及采集者姓名。
樟脑混合剂配制：樟脑粉6份，氯仿1份，木馏油1份，石蜡油4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合，随后加樟脑1.5份与木馏油1份，用玻璃棒混匀，最后加樟脑粉3份及石蜡油4份，再搅匀备用。此混合剂易燃，宜置于严密而不透气的瓶内储藏。
常用固定液配制：
⑴酒精：通常用70%或75%酒精为固定液。用商品供应95%酒精作稀释配制。取95%酒精加至需要稀释的浓度，再加蒸馏水到95ml即可；或者，可按下列稀释公式配制：
所需酒精浓度 ×配成酒精量=所需原酒精量（ml）
原酒精浓度
配成酒精量-所需原酒精量=应加蒸馏水量（ml）
⑵福尔马林（37%～40%的甲醛水溶液）：常用固定液的浓度为5%～10%。如需保持中性，在配制过程中，可在500ml原液（37%～40%的甲醛水溶液）加入约2cm厚碳酸镁，或放几小块大理石（碳酸钙）中和之；也可采用下列配方配制（10%福尔马林）：福尔马林原液100ml，蒸馏水900ml，碳酸二氢钠（Na2H2PO4·H2O）4g，碳酸氢二钠（Na2H2PO4）0.5g混合配成。
⑶布氏（Bless）液：福尔马林原液7ml，酒精（70%）90ml，冰醋酸（临用前加入）3～5ml混合配成。
四、原虫低温保存
用液氮保存原虫，具有保持原虫生物学特性，且保存时间较长的优点。现仅介绍疟原虫、弓形虫、人毛滴虫及阴道毛滴虫的低温保存方法。
1.冻存方法
恶性疟原虫：将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的培养物，经1500rpm离心10分钟，加入与沉积细胞等量的24%二甲基亚砜（DMSO）生理盐水溶液（0.9%生理盐水或5%葡萄糖生理盐水76ml中加入DMSO24ml）保护剂，充分混匀后在室温中放置30分钟，按0.5～1.0ml分装入无菌安瓿（或塑料管）内，封口（或盖严）后将之放入标明批号的纱布袋中，装于液氮罐的提筒内，先置于液氮罐的颈部，该处约为-70℃，30分钟后，置液氮中（-196℃）冻存。
鼠疟原虫：从感染疟原虫第3～4天的小鼠心脏取血（或摘除眼球取血），注入试管，肝素抗凝，加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清为保护剂；或加入等体积的甘油、山梨醇保护液（4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml），充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1mm3阳性鼠血加0.1mm3的3.8%枸橼酸钠抗凝之后就装于液氮罐提筒中，立即直接置液氮中保存，2年内多数原虫仍有活力。
弓形虫：用无菌注射器吸取10%DMSO2ml，注入感染4天的小鼠腹腔，抽洗2次，抽出液混匀后即注入无菌塑料管内（0.5～1ml/管），冻存法同上。
阴道毛滴虫：用无菌拭子取阴道分泌物，放入培养基中培养48小时，转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫培养液经1000rpm/min离心10分钟，在沉淀中加入10%DMSO2ml，同上法分装及冻存。
人毛滴虫：取腹泻患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时，转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数（达7×105）。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10℃中15分钟，移到液氮罐颈2分钟，再置入液氮中冻存。
上述所用的保护剂（液）均应经高压灭菌，保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO，用时再稀释所需浓度，加15%或20%小牛血清，调pH至7.2。
2.复苏与观察在冻存1～2年，需要时从液氮罐中取出保种的小管，迅速投入37～40℃温水中，经4～5分钟即溶化。取冻存的鼠疟原虫和弓形虫分别经腹腔接种2只小鼠，每只0.2ml，观察致病情况；也可接种后4～5天分别取鼠血或腹腔液，作涂片，姬氏液染色，镜检原虫。两种毛滴虫可用同样方法复苏，但需经培养3～4天后，作涂片镜检活动滋养体，或染色观察。
第五节 寄生虫标本的包装与邮寄
液浸标本 即用70%酒精或5%～10%福尔马林等固定液保存的标本，装于大小适当的玻璃瓶或塑料管（瓶）内，附上铅笔写的记录标签，如满保存液，不留空隙，盖紧瓶（管）塞，用蜡封口，随后，将之放于木匣内，两者之间的四周可用碎纸或棉花塞紧，将木匣装钉严密，匣面注明瓶子朝上一端的记号，即可邮寄。
干制标本 主要是干制昆虫标本，单个针插于玻璃管内或多量昆虫存放于玻璃瓶（管）内，同上法装放于木匣内邮寄。
玻片标本 一般可将每两张玻片背对背地合并，然后在玻片两端用厚纸片或火柴杆隔开，每20～30张玻片，用纸包好，用线（或橡皮筋）扎紧，同上述方法放在木匣（小木箱）内邮寄；也可放在玻片标本盒内，在玻片之间用棉花或软纸塞紧，再装于小匣内邮寄。应在标本匣和木匣（箱）的上下四周之空隙适当地塞些废纸或棉絮，以免震损标本。
活体标本 邮寄活的蚊卵，须先将产在潮湿的滤纸或尼龙纱上的蚊卵，置室温中经48小时，待卵发育成熟，才可将带有蚊卵的潮湿滤纸或湿尼龙纱，放在薄膜塑料袋里，后可直接放于信封内航寄（远途）。蜱螨类活标本，可取一广口瓶，放入潮湿的沙土和一块折皱的滤纸，将蜱或螨放进瓶中，用棉花塞瓶口，然后另取一较大的广口瓶，瓶底垫以湿棉花。将装有活标本的瓶子放入此瓶内,塞上有缺口的软木塞(将软木塞两侧纵割一缺口),在缺口处塞以棉花.邮寄时，将大口瓶放在木箱内， 木箱上应钻有通气孔。广口瓶可按上述瓶装标本装匣方法及标志记号再寄出。活的钉螺可用湿吸水纸包好，放在小竹筒内，周围塞些湿棉花，在竹筒四周扎几个小孔，竹筒开口的一端要蒙上二层纱布，外再以胶布封严邮寄；也可将以几层湿纸包裹的钉螺放在小木匣内，木匣周围凿小孔，钉好木匣，邮寄。 |
